Er studierte zunächst Mathematik und Philosophie in München und promovierte schon 1880 mit einer preisgekrönten Arbeit zum Doktor der Philosophie. Später studierte er Theologie. Sein Name ist unlösbar verbunden mit der Geschichte des armenischen Volkes. Der Autor Franz Werfel setzte ihm in seinen Werk »Die vierzig Tage des Musa Dagh« ein Denkmal und nannte ihn den von Gott gesandten »Schutzengel der Armenier«.
Johannes Lepsius war der jüngste Sohn des Begründers der Ägyptologie in Deutschland, des Ägyptologen Carl Richard Lepsius und seiner Ehefrau Elisabeth, geb. Klein (1828–1899), einer Urenkelin des Berliner Aufklärers Friedrich Nicolai. Johannes Lepsius wuchs in einem Elternhaus mit großem intellektuellen Horizont auf. Im Hause Lepsius trafen sich viele wichtige Persönlichkeiten des Kaiserreiches aus Politik, Kultur und Kirche.
Sein Hauptwerk ist das von ihm ins Leben gerufene und durch Jahrzehnte effektiv arbeitende Armenische Hilfswerk. Als Reaktion auf die hamidischen Armeniermassaker 1894 bis 1896, die bereits genozidalen Charakter hatten, gründete er schon 1896/1897 in einer großen humanitären Werbekampagne, die ihn durch ganz Deutschland führte, sein Hilfswerk. Es wurden Hilfsstationen sowohl in der Türkei als auch in Persien und Bulgarien aufgebaut, denn die von Mord und Totschlag bedrohten Christen flüchteten damals aus der Türkei in jene Länder.
Später kamen nach dem Völkermord an den Armeniern, den die Türken im Schatten des Ersten Weltkriegs (1915/16) verübten, Flüchtlingsheime und Waisenhäuser sowie Armenier-Neusiedlungen in Syrien und Libanon hinzu. 1914 war er Mitbegründer der in Berlin gegründeten Deutsch-Armenischen Gesellschaft.